547例Dravet综合征患儿<i>SCN1A</i>基因突变与遗传特点研究_《癫痫杂志》

作者：

 田小娟 ¹ ,  张月华 ¹ , 杨小玲 ¹ , 许小菁 ² , 刘爱杰 ¹ , 刘晓燕 ¹ , 杨志仙 ¹ , 吴晔 ¹ , 姜玉武 ¹ , 吴希如 ¹

1. 北京大学第一医院儿科, 北京, 100034;
2. 北京中日友好医院儿科, 北京, 100029;

关键词：

Dravet综合征 SCN1A基因新生突变遗传性突变突变嵌合体

DOI：

10.7507/2096-0247.20160001

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献

目的研究Dravet综合征(Dravet syndrome, DS)患儿SCN1A基因突变与遗传特点, 分析家系成员临床表型方法收集2005年2月-2015年4月在北京大学第一医院儿科就诊的DS患儿及其家系成员的临床资料及外周血DNA, 采用Sanger测序和多重连接依赖的探针扩增技术(Multiple ligation-dependent probe amplification, MLPA)进行SCN1A基因突变筛查。结果共收集547例DS患儿, 有379例(69.3%)发现SCN1A基因突变, 其中错义突变179例(47.2%), 无义突变78例(20.6%), 移码突变77例(20.3%), 剪切位点突变37例(9.8%), 基因片段缺失或重复8例(2.1%)。379例SCN1A突变阳性的DS患儿中, 354例均获得其父母外周血DNA, 证实新生突变占92.9%(329/354), 遗传性突变占7.1%(25/354), 遗传性突变包括5例父母一方为突变嵌合体。25例携带突变的父母一方中有1例表型为DS, 11例表型为热性惊厥附加症, 9例表型为热性惊厥, 4例表型正常。结论 DS患儿SCN1A基因突变阳性率高, 突变类型以错义突变和截断突变(包括无义突变和移码突变)为主, 少数患儿为该基因片段缺失或重复; DS患儿SCN1A基因突变以新生突变为主, 少数为遗传性突变, 父母一方可为该基因突变嵌合体; 携带突变的父母一方表型轻重不等, 父母一方为突变嵌合体者临床表型轻或正常。

引用本文： 田小娟, 张月华, 杨小玲, 许小菁, 刘爱杰, 刘晓燕, 杨志仙, 吴晔, 姜玉武, 吴希如. 547例Dravet综合征患儿SCN1A基因突变与遗传特点研究. 癫痫杂志, 2016, 2(1): 3-8. doi: 10.7507/2096-0247.20160001 复制

Dravet综合征(Dravet syndrome，DS)是一种难治性癫痫综合征，属于癫痫性脑病。1978年由法国医生Dravet首次报道，既往又称婴儿严重肌阵挛癫痫(Severe myoclonic epilepsy of infancy，SMEI)，2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)将本病命名为Dravet综合征，该病1岁以内主要表现为发热诱发的发作，1岁后逐渐出现多种形式的无热发作，但发作仍具有热敏感性，且易出现癫痫持续状态，有不同程度的智力损害，对抗癫痫药物(AEDs)治疗效果差^[1]。文献报道其死亡率明显高于其他癫痫综合征^[2]。SCN1A基因是DS的主要致病基因，该基因编码电压门控钠离子通道α1亚单位。文献报道，在DS患儿中该基因突变率约为70%^[3]，其中90%～95%为新生突变，5%～10%为遗传性突变^{[4, 5]}。本研究对DS患儿SCN1A基因突变类型、遗传特点及家系受累成员临床表型进行总结，为遗传咨询提供指导。

资料与方法

1 研究对象

收集2005年2月-2015年4月在北京大学第一医院儿科就诊的DS患儿及其家系成员的临床资料和外周血DNA，该项研究获得北京大学第一医院伦理委员会的批准，所有患儿及其家系成员均签署知情同意书。

对每例患儿均建立临床登记表，内容包括姓名、性别、出生日期、民族、发病年龄、发作表现、辅助检查结果、用药史、围产期情况、既往史、家族史。根据ILAE有关癫痫综合征的分类并参照Baulac等^[6]描述的DS临床特点进行诊断，诊断标准为：①1岁以内常以热性惊厥起病(高峰年龄为生后6个月)；②1 ~ 4岁出现多种形式的无热惊厥，包括全面性或半侧阵挛或强直阵挛发作、肌阵挛发作、不典型失神、部分性发作等；③发作具有热敏感的特点；④易发生癫痫持续状态；⑤1岁以内智力运动发育正常，以后逐渐出现精神运动发育落后或倒退；可有共济失调和锥体束征；⑥脑电图( EEG)在1岁以前多正常，1岁以后出现全导棘慢波、多棘慢波或局灶性、多灶性痫样放电；⑦多数患儿对抗癫痫药物(AEDs)疗效差。家系中其他成员表型诊断根据2010年ILAE的癫痫发作和癫痫综合征修订标准^[7]进行诊断。

2 研究方法

2.1 患儿SCN1A基因检测

收集患儿及家系成员的外周血，提取DNA。对患儿外周血DNA采用PCR扩增及Sanger测序法进行SCN1A基因检测。测序结果应用DNA Star软件包中的Segman^TM软件进行序列对比分析，必要时以反向引物进行测序验证。对Sanger测序法未发现SCN1A基因突变的患儿，采用多重连接依赖的探针扩增(Multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA)方法，分析SCN1A基因片段缺失或重复。正常序列为GenBank中SCN1A全基因组序列(NC_000002)，编码区序列(CDS_AB093548)，蛋白质序列(P35498)。排除标准包括在家系和100个正常对照均存在的核苷酸变异，同义突变以及在HGMD专业版数据库、Pubmed数据库及UCSC数据库中已标明的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymophism SNP)。蛋白质家族结构域依据ScanProsite (http://www.Expasy.org/)数据库(PRO_0000048489)，蛋白质保守性分析依据ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。

2.2 患儿父母SCN1A基因检测

对存在SCN1A基因突变且可获取家系成员外周血标本的患儿，进一步筛查父母SCN1A基因突变，分析其突变来源，并对携带突变的父母一方临床表型进行分析。

结果

1 SCN1A基因突变分析

共收集547例DS患儿，男303例，女244例。有379例(69.3%)患儿发现SCN1A突变，168例(30.7%)患儿未发现SCN1A突变。其中采用PCR和Sanger测序法发现179例错义突变(47.2%)，79例无义突变(20.6%)，77例移码突变(20.3%)，37例剪切位点突变(9.8%)，采用MLPA方法分析发现8例(2.1%)，其中基因片段缺失7例，基因片段重复1例。

2 SCN1A基因突变来源分析结果

379例SCN1A阳性的DS患儿中，354例获得父母外周血DNA，证实新生突变329例(92.9%)，遗传性突变25例(7.1%，其中错义突变18例，无义突变3例，剪切位点突变2例，碱基缺失导致移码突变2例)。25例遗传性突变的患儿中(表 1、2)，20例患儿其父母一方为SCN1A相同位点杂合突变，5例患儿其父母一方Sanger测序图存在与先证者完全相同的碱基缺失，但其杂合峰较野生型峰低，表明其体细胞部分存在突变，属于体细胞嵌合体，见图 1、2。

表1 20例DS患儿SCN1A突变来自父母一方杂合突变的临床资料分析 Table1. The clinical data of 20 SCN1A-positive DS families with one heterozygous transmitting parent

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表1 20例DS患儿SCN1A突变来自父母一方杂合突变的临床资料分析 Table1. The clinical data of 20 SCN1A-positive DS families with one heterozygous transmitting parent

家系 Pedigree	性别 Sex	起病年龄(月) Age of onset (Months)	发作类型 Seizure type	SE	热敏感 Heat-sensitive	发育落后 Retardation	随访年龄(岁) Follow-up age (Year)	SCN1A突变位点 SCNIA mutation site	对应氨基酸改变 Related amino acid change	受累成员例数 Cases of involved members	其他受累成员表型 Phenotype of other involved members	携带SCN1A突变的父母一方表型(末次发作年龄，岁) Phenotype of parents carrying SCNIA mutation
1	女Female	7	GTCS、PS	-	+	+	7	c.1046A > G	Y349C	2	FS+	父Father：FS+(8)
2	男Male	8	PS、aTAS	-	+	+	10	c.4973C > T	T1658M	3	FS, EP	母 Mother：FS(5)
3	女Female	4	GTCS、PS、MS	+	+	+	8	c.2523_2524delGC	T841fsx842	2	FS+	父 Father：FS+(36)
4	男Male	5	GTCS	-	+	+	5	c.568T > C	W190R	1	/	母 Mother：正常	Normal
5	女Female	10	GTCS、PS	+	+	+	7	c.4168G > C	V1390L	3	FS+	父 Father：FS+(23)
6	男Male	6	GTCS、PS、aTAS	-	+	-	7	c.1130G > A	R377Q	6	FS	母 Mother：正常	Normal
7	男Male	3	GTCS、PS	+	+	+	4	c.3661G > C	E1221Q	4	FS、FS+	父 Father：FS+(8)
8	男Male	5	GTCS、PS	+	+	+	2	c.2929G > A, c.4786C > T	V977M, R1596C	3	FS+、AGTCS	母 Mother：FS+(8)
9	男Male	2	GTCS、PS	+	+	+	2	c.695-1G > A	IVS6-1G > A	2	FS+	父 Father：FS+(12)
10	女Female	4	GTCS、PS	+	+	+	9	c.302G > A	R101Q	3	FS+、DS	母 Mother：FS+(9)
11	男Male	8	GTCS、PS	+	+	-	5	c.473+1G > C	IVS3+1G > C	2	FS	父 Father：FS(2)
12	男Male	12	GTCS、PS、MS	-	+	-	5	c.5780G > C	R1927T	3	FS+、EP	母 Mother:FS+(10)
13	女Female	6.5	GTCS、PS	+	+	-	2.5	c.2378C > T, c.3995G > A	T793M, G1332E	2	FS+	母 Mother：FS+(8)
14	女Female	7	GTCS、PS	+	+	-	4	c.3801G > T	M1267I	2	FS	父 Father：FS(6)
15	女Female	10	GTCS	+	+	-	3.5	c.3692G > A	S1231N	2	FS	父 Father：正常	Normal
16	男Male	7	GTCS、PS、aTAS	+	+	-	6	c.2603A > C	K868T	2	FS	父 Father：FS(5)
17	女Female	8	GTCS、PS、MS	+	+	-	4	c.2707A > T	I903F	1	/	母 Mother：正常	Normal
18	男Male	6	GTCS	-	+	-	8	c.1169T > C	L390P	2	DS	母 Mother：DS(43)
19	女Female	8	GTCS	-	+	+	5.5	c.391A > T, c.2878A > G	S131C, M966V	2	FS	母 Mother：FS(4)
20	男Male	7.5	GTCS、PS	+	+	-	2.5	c.314C > T	T105I	4	FS、FS+	父 Father：FS+(8)

表2 5例DS患儿SCN1A突变来自父母一方嵌合突变的临床资料分析 Table2. The clinical data of 5 SCN1A-positive DS families with one mosaic transmitting parent

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家系 Pedigree	性别 Sex	起病年龄(月) Age of onset (Months)	发作类型 Seizure type	SE	热敏感 Heat-sensitive	发育落后 Retardation	随访年龄(岁) Follow-up age (Year)	SCN1A突变位点 SCNIA mutation site	对应氨基酸改变 Related amino acid change	受累成员例数 Cases of involved members	其他受累成员表型 Phenotype of other involved members	携带SCN1A突变的父母一方表型(末次发作年龄，岁) Phenotype of parents carrying SCNIA mutation
21	男Male	5	GTCS、PS、MS、aTAS	+	+	+	14	c.1118delT	L373fsX378	3	FS、FS+	父 Father：FS+(9)
22	男Male	3	GTCS、PS	+	+	+	7	c.2593C > T	R865X	9	FS	父 Father：FS(4)
23	男Male	7	GTCS、PS、MS	-	+	+	6	c.5003C > G	P1668R	2	FS	母 Mother：FS(5)
24	女Female	5	PS、MS	+	+	+	9	c.4302G > A	W1434X	3	FS、FS+	母 Mother：FS(3)
25	男Male	6	GTCS	-	+	+	8	c.5656C > T	R1886X	4	FS、FS+	母	Mother：FS(2)
注：GTCS：全面强直阵挛发作；PS：部分性发作；aTAS：不典型失神发作；MS：肌阵挛发作；SE：癫痫持续状态；FS:热性惊厥；FS+：热性惊厥附加症；DS：Dravet综合征；AGTCS：无热全面强直阵挛发作

图1 5个嵌合突变遗传家系的家系图(箭头示先证者，m表示突变型，＋表示野生型) Figure1. Pedigrees of 5 DS families with one mosaic parent

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图2 5个嵌合突变遗传家系的SCN1A基因突变测序图(箭头示突变位点) Figure2. Sanger sequencing of 5 DS families with one mosaic parent

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3 家系受累成员临床表型

在20例父母一方为杂合突变的患儿中，10例患儿SCN1A突变来源于父亲，10例来源于母亲(表 1)。携带突变的父母一方中，1例母亲表型为Dravet综合征(家系18)，该患儿母亲生后6个月出现反复抽搐发作，具有热敏感性，9岁出现无热抽搐，末次随访43岁，仍有反复无热强直阵挛发作，10~12次/年，有智力障碍，临床表型符合Dravet综合征；10例携带突变的父母一方表型为热性惊厥附加症(FS+)，智力均正常(分别见家系1、家系3、家系5、家系7、家系8、家系9、家系10、家系12、家系13和家系20)；5例携带突变的父母一方表型为热性惊厥(FS)，智力均正常(分别见家系2、家系11、家系14、家系16和家系19)。4例携带突变的父母一方表型正常(分别见家系4、家系6、家系15和家系17)。

在5例父母一方为突变嵌合体的患儿中，2例患儿SCN1A突变来源于父亲，3例来源于母亲(表 2、图 1)，其中1例携带突变的父亲表型为FS+(家系21)，智力正常。4例携带突变的父母一方表型为FS(家系22、家系23、家系24和家系25)，智力均正常。

讨论

Dravet综合征的主要致病基因为SCN1A，目前发现该基因是与癫痫发病相关的最重要的基因之一^[4]，其导致的癫痫临床表型有DS、全面性癫痫伴热性惊厥附加症(Generalised epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+)、肌阵挛-失张力癫痫(Myoclonic-atonic epilepsy，MAE)等^{[3, 8, 9]}，该基因与DS临床表型最为密切，阳性率在70%左右。目前国际上已报道超过900种SCN1A基因突变类型与DS表型相关(http://www.gzneurosci.com/scn1adata-base/scn1a_variant.php)，且无热点突变。采用Sanger测序法发现错义突变与截断突变(包括无义突变和移码突变)各占约40%，其余突变类型为剪切位点突变。在SCN1A基因Sanger测序检测突变阴性的患儿中，采用MLPA方法发现SCN1A基因部分外显子甚至整个基因缺失或重复导致的染色体重排^{[10, 11]}。本研究显示547例DS患儿中，379例发现SCN1A基因突变，阳性率为69.3%，其中错义突变47.2%，截断突变40.9%(包括无义突变20.6%和移码突变20.3%)，剪切位点突变9.8%，基因片段缺失或重复2.1%，与国际报道基本一致^[3]。本研究中有30.7%的患儿未发现SCN1A基因突变，不除外存在其他基因突变参与DS发病的可能，DS目前报道的基因突变有SCN1A、PCDH19、GABRG2、SCN1B、SCN9A、GABRA1等^[12-15]。本课题组下一步计划对SCN1A阴性的DS患儿采用二代测序(Next generation sequencing)，进一步明确是否存在其他基因突变。

DS患儿多数为散发病例，少数患儿可有热性惊厥或癫痫家族史，家系成员的临床表型轻重不一。文献报道SCN1A阳性的DS患儿中大多数突变为新生突变，少数为遗传性突变，且父母一方可能为SCN1A突变嵌合体^[16-18]。Depienne等^[16]研究了177例SCN1A基因突变患儿父母的SCN1A基因，发现19例遗传性突变，其中采用定量等位基因特异性PCR方法证实12例患儿的父母一方表现为体细胞突变嵌合体。该文献显示DS家系遗传性突变中，部分可为嵌合突变遗传，即携带SCN1A基因突变的父母一方为突变嵌合体，可以遗传给子代，导致表型严重的DS。本研究中有25例患儿为遗传性突变，其中5例父母一方为该基因突变嵌合体，突变定量需进一步研究。

另外由于Sanger测序存在检测极限，本研究组计划对329例新生突变家系进行实时定量测定，在部分“新生突变”家系可能发现Sanger测序图不易发现的嵌合突变。对父亲为突变嵌合体者，可进一步对其精子突变嵌合体进行定量分析，为遗传咨询及产前诊断提供更准确更可靠的指导。

在DS遗传性突变家系中，携带SCN1A基因突变的家系成员临床表型轻重不一，可表现为DS、FS+或FS，也可完全正常^{[5, 19]}。Depienne等^[16]报道的19例遗传性突变导致的DS患儿中，10例携带突变的父母一方表型较轻，为FS、FS+、特发性全面性癫痫等，9例表型正常(其中7例为突变嵌合体遗传)。本研究中，20例携带杂合突变的父母一方中，1例表型为DS，10例表型为FS+，5例表型为FS，4例表型正常。在5例携带嵌合突变的父母一方中，1例表型为FS+，4例表型为FS，与遗传性杂合突变的父母相比，表型较轻，与国际报道一致。

DS是一种难治性癫痫综合征，多数患儿预后不良，有智力损害，且癫痫猝死(Sudden unexpected death of epilepsy, SUDEP)发生率高^[20]。对疑似DS的患儿进行SCN1A基因突变检测有利于早期明确诊断和指导选择AEDs。对DS患儿SCN1A突变来源进行分析，可指导遗传咨询和产前诊断。