引用本文: 田小娟, 张月华, 杨小玲, 许小菁, 刘爱杰, 刘晓燕, 杨志仙, 吴晔, 姜玉武, 吴希如. 547例Dravet综合征患儿SCN1A基因突变与遗传特点研究. 癫痫杂志, 2016, 2(1): 3-8. doi: 10.7507/2096-0247.20160001 复制
Dravet综合征(Dravet syndrome,DS)是一种难治性癫痫综合征,属于癫痫性脑病。1978年由法国医生Dravet首次报道,既往又称婴儿严重肌阵挛癫痫(Severe myoclonic epilepsy of infancy,SMEI),2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)将本病命名为Dravet综合征,该病1岁以内主要表现为发热诱发的发作,1岁后逐渐出现多种形式的无热发作,但发作仍具有热敏感性,且易出现癫痫持续状态,有不同程度的智力损害,对抗癫痫药物(AEDs)治疗效果差[1]。文献报道其死亡率明显高于其他癫痫综合征[2]。SCN1A基因是DS的主要致病基因,该基因编码电压门控钠离子通道α1亚单位。文献报道,在DS患儿中该基因突变率约为70%[3],其中90%~95%为新生突变,5%~10%为遗传性突变[4, 5]。本研究对DS患儿SCN1A基因突变类型、遗传特点及家系受累成员临床表型进行总结,为遗传咨询提供指导。
资料与方法
1 研究对象
收集2005年2月-2015年4月在北京大学第一医院儿科就诊的DS患儿及其家系成员的临床资料和外周血DNA,该项研究获得北京大学第一医院伦理委员会的批准,所有患儿及其家系成员均签署知情同意书。
对每例患儿均建立临床登记表,内容包括姓名、性别、出生日期、民族、发病年龄、发作表现、辅助检查结果、用药史、围产期情况、既往史、家族史。根据ILAE有关癫痫综合征的分类并参照Baulac等[6]描述的DS临床特点进行诊断,诊断标准为:①1岁以内常以热性惊厥起病(高峰年龄为生后6个月);②1 ~ 4岁出现多种形式的无热惊厥,包括全面性或半侧阵挛或强直阵挛发作、肌阵挛发作、不典型失神、部分性发作等;③发作具有热敏感的特点;④易发生癫痫持续状态;⑤1岁以内智力运动发育正常,以后逐渐出现精神运动发育落后或倒退;可有共济失调和锥体束征;⑥脑电图( EEG)在1岁以前多正常,1岁以后出现全导棘慢波、多棘慢波或局灶性、多灶性痫样放电;⑦多数患儿对抗癫痫药物(AEDs)疗效差。家系中其他成员表型诊断根据2010年ILAE的癫痫发作和癫痫综合征修订标准[7]进行诊断。
2 研究方法
2.1 患儿SCN1A基因检测
收集患儿及家系成员的外周血,提取DNA。对患儿外周血DNA采用PCR扩增及Sanger测序法进行SCN1A基因检测。测序结果应用DNA Star软件包中的SegmanTM软件进行序列对比分析,必要时以反向引物进行测序验证。对Sanger测序法未发现SCN1A基因突变的患儿,采用多重连接依赖的探针扩增(Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)方法,分析SCN1A基因片段缺失或重复。正常序列为GenBank中SCN1A全基因组序列(NC_000002),编码区序列(CDS_AB093548),蛋白质序列(P35498)。排除标准包括在家系和100个正常对照均存在的核苷酸变异,同义突变以及在HGMD专业版数据库、Pubmed数据库及UCSC数据库中已标明的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymophism SNP)。蛋白质家族结构域依据ScanProsite (http://www.Expasy.org/)数据库(PRO_0000048489),蛋白质保守性分析依据ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。
2.2 患儿父母SCN1A基因检测
对存在SCN1A基因突变且可获取家系成员外周血标本的患儿,进一步筛查父母SCN1A基因突变,分析其突变来源,并对携带突变的父母一方临床表型进行分析。
结果
1 SCN1A基因突变分析
共收集547例DS患儿,男303例,女244例。有379例(69.3%)患儿发现SCN1A突变,168例(30.7%)患儿未发现SCN1A突变。其中采用PCR和Sanger测序法发现179例错义突变(47.2%),79例无义突变(20.6%),77例移码突变(20.3%),37例剪切位点突变(9.8%),采用MLPA方法分析发现8例(2.1%),其中基因片段缺失7例,基因片段重复1例。
2 SCN1A基因突变来源分析结果
379例SCN1A阳性的DS患儿中,354例获得父母外周血DNA,证实新生突变329例(92.9%),遗传性突变25例(7.1%,其中错义突变18例,无义突变3例,剪切位点突变2例,碱基缺失导致移码突变2例)。25例遗传性突变的患儿中(表 1、2),20例患儿其父母一方为SCN1A相同位点杂合突变,5例患儿其父母一方Sanger测序图存在与先证者完全相同的碱基缺失,但其杂合峰较野生型峰低,表明其体细胞部分存在突变,属于体细胞嵌合体,见图 1、2。




3 家系受累成员临床表型
在20例父母一方为杂合突变的患儿中,10例患儿SCN1A突变来源于父亲,10例来源于母亲(表 1)。携带突变的父母一方中,1例母亲表型为Dravet综合征(家系18),该患儿母亲生后6个月出现反复抽搐发作,具有热敏感性,9岁出现无热抽搐,末次随访43岁,仍有反复无热强直阵挛发作,10~12次/年,有智力障碍,临床表型符合Dravet综合征;10例携带突变的父母一方表型为热性惊厥附加症(FS+),智力均正常(分别见家系1、家系3、家系5、家系7、家系8、家系9、家系10、家系12、家系13和家系20);5例携带突变的父母一方表型为热性惊厥(FS),智力均正常(分别见家系2、家系11、家系14、家系16和家系19)。4例携带突变的父母一方表型正常(分别见家系4、家系6、家系15和家系17)。
在5例父母一方为突变嵌合体的患儿中,2例患儿SCN1A突变来源于父亲,3例来源于母亲(表 2、图 1),其中1例携带突变的父亲表型为FS+(家系21),智力正常。4例携带突变的父母一方表型为FS(家系22、家系23、家系24和家系25),智力均正常。
讨论
Dravet综合征的主要致病基因为SCN1A,目前发现该基因是与癫痫发病相关的最重要的基因之一[
DS患儿多数为散发病例,少数患儿可有热性惊厥或癫痫家族史,家系成员的临床表型轻重不一。文献报道SCN1A阳性的DS患儿中大多数突变为新生突变,少数为遗传性突变,且父母一方可能为SCN1A突变嵌合体[16-18]。Depienne等[16]研究了177例SCN1A基因突变患儿父母的SCN1A基因,发现19例遗传性突变,其中采用定量等位基因特异性PCR方法证实12例患儿的父母一方表现为体细胞突变嵌合体。该文献显示DS家系遗传性突变中,部分可为嵌合突变遗传,即携带SCN1A基因突变的父母一方为突变嵌合体,可以遗传给子代,导致表型严重的DS。本研究中有25例患儿为遗传性突变,其中5例父母一方为该基因突变嵌合体,突变定量需进一步研究。
另外由于Sanger测序存在检测极限,本研究组计划对329例新生突变家系进行实时定量测定,在部分“新生突变”家系可能发现Sanger测序图不易发现的嵌合突变。对父亲为突变嵌合体者,可进一步对其精子突变嵌合体进行定量分析,为遗传咨询及产前诊断提供更准确更可靠的指导。
在DS遗传性突变家系中,携带SCN1A基因突变的家系成员临床表型轻重不一,可表现为DS、FS+或FS,也可完全正常[5, 19]。Depienne等[16]报道的19例遗传性突变导致的DS患儿中,10例携带突变的父母一方表型较轻,为FS、FS+、特发性全面性癫痫等,9例表型正常(其中7例为突变嵌合体遗传)。本研究中,20例携带杂合突变的父母一方中,1例表型为DS,10例表型为FS+,5例表型为FS,4例表型正常。在5例携带嵌合突变的父母一方中,1例表型为FS+,4例表型为FS,与遗传性杂合突变的父母相比,表型较轻,与国际报道一致。
DS是一种难治性癫痫综合征,多数患儿预后不良,有智力损害,且癫痫猝死(Sudden unexpected death of epilepsy, SUDEP)发生率高[20]。对疑似DS的患儿进行SCN1A基因突变检测有利于早期明确诊断和指导选择AEDs。对DS患儿SCN1A突变来源进行分析,可指导遗传咨询和产前诊断。
Dravet综合征(Dravet syndrome,DS)是一种难治性癫痫综合征,属于癫痫性脑病。1978年由法国医生Dravet首次报道,既往又称婴儿严重肌阵挛癫痫(Severe myoclonic epilepsy of infancy,SMEI),2001年国际抗癫痫联盟(ILAE)将本病命名为Dravet综合征,该病1岁以内主要表现为发热诱发的发作,1岁后逐渐出现多种形式的无热发作,但发作仍具有热敏感性,且易出现癫痫持续状态,有不同程度的智力损害,对抗癫痫药物(AEDs)治疗效果差[1]。文献报道其死亡率明显高于其他癫痫综合征[2]。SCN1A基因是DS的主要致病基因,该基因编码电压门控钠离子通道α1亚单位。文献报道,在DS患儿中该基因突变率约为70%[3],其中90%~95%为新生突变,5%~10%为遗传性突变[4, 5]。本研究对DS患儿SCN1A基因突变类型、遗传特点及家系受累成员临床表型进行总结,为遗传咨询提供指导。
资料与方法
1 研究对象
收集2005年2月-2015年4月在北京大学第一医院儿科就诊的DS患儿及其家系成员的临床资料和外周血DNA,该项研究获得北京大学第一医院伦理委员会的批准,所有患儿及其家系成员均签署知情同意书。
对每例患儿均建立临床登记表,内容包括姓名、性别、出生日期、民族、发病年龄、发作表现、辅助检查结果、用药史、围产期情况、既往史、家族史。根据ILAE有关癫痫综合征的分类并参照Baulac等[6]描述的DS临床特点进行诊断,诊断标准为:①1岁以内常以热性惊厥起病(高峰年龄为生后6个月);②1 ~ 4岁出现多种形式的无热惊厥,包括全面性或半侧阵挛或强直阵挛发作、肌阵挛发作、不典型失神、部分性发作等;③发作具有热敏感的特点;④易发生癫痫持续状态;⑤1岁以内智力运动发育正常,以后逐渐出现精神运动发育落后或倒退;可有共济失调和锥体束征;⑥脑电图( EEG)在1岁以前多正常,1岁以后出现全导棘慢波、多棘慢波或局灶性、多灶性痫样放电;⑦多数患儿对抗癫痫药物(AEDs)疗效差。家系中其他成员表型诊断根据2010年ILAE的癫痫发作和癫痫综合征修订标准[7]进行诊断。
2 研究方法
2.1 患儿SCN1A基因检测
收集患儿及家系成员的外周血,提取DNA。对患儿外周血DNA采用PCR扩增及Sanger测序法进行SCN1A基因检测。测序结果应用DNA Star软件包中的SegmanTM软件进行序列对比分析,必要时以反向引物进行测序验证。对Sanger测序法未发现SCN1A基因突变的患儿,采用多重连接依赖的探针扩增(Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)方法,分析SCN1A基因片段缺失或重复。正常序列为GenBank中SCN1A全基因组序列(NC_000002),编码区序列(CDS_AB093548),蛋白质序列(P35498)。排除标准包括在家系和100个正常对照均存在的核苷酸变异,同义突变以及在HGMD专业版数据库、Pubmed数据库及UCSC数据库中已标明的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymophism SNP)。蛋白质家族结构域依据ScanProsite (http://www.Expasy.org/)数据库(PRO_0000048489),蛋白质保守性分析依据ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。
2.2 患儿父母SCN1A基因检测
对存在SCN1A基因突变且可获取家系成员外周血标本的患儿,进一步筛查父母SCN1A基因突变,分析其突变来源,并对携带突变的父母一方临床表型进行分析。
结果
1 SCN1A基因突变分析
共收集547例DS患儿,男303例,女244例。有379例(69.3%)患儿发现SCN1A突变,168例(30.7%)患儿未发现SCN1A突变。其中采用PCR和Sanger测序法发现179例错义突变(47.2%),79例无义突变(20.6%),77例移码突变(20.3%),37例剪切位点突变(9.8%),采用MLPA方法分析发现8例(2.1%),其中基因片段缺失7例,基因片段重复1例。
2 SCN1A基因突变来源分析结果
379例SCN1A阳性的DS患儿中,354例获得父母外周血DNA,证实新生突变329例(92.9%),遗传性突变25例(7.1%,其中错义突变18例,无义突变3例,剪切位点突变2例,碱基缺失导致移码突变2例)。25例遗传性突变的患儿中(表 1、2),20例患儿其父母一方为SCN1A相同位点杂合突变,5例患儿其父母一方Sanger测序图存在与先证者完全相同的碱基缺失,但其杂合峰较野生型峰低,表明其体细胞部分存在突变,属于体细胞嵌合体,见图 1、2。




3 家系受累成员临床表型
在20例父母一方为杂合突变的患儿中,10例患儿SCN1A突变来源于父亲,10例来源于母亲(表 1)。携带突变的父母一方中,1例母亲表型为Dravet综合征(家系18),该患儿母亲生后6个月出现反复抽搐发作,具有热敏感性,9岁出现无热抽搐,末次随访43岁,仍有反复无热强直阵挛发作,10~12次/年,有智力障碍,临床表型符合Dravet综合征;10例携带突变的父母一方表型为热性惊厥附加症(FS+),智力均正常(分别见家系1、家系3、家系5、家系7、家系8、家系9、家系10、家系12、家系13和家系20);5例携带突变的父母一方表型为热性惊厥(FS),智力均正常(分别见家系2、家系11、家系14、家系16和家系19)。4例携带突变的父母一方表型正常(分别见家系4、家系6、家系15和家系17)。
在5例父母一方为突变嵌合体的患儿中,2例患儿SCN1A突变来源于父亲,3例来源于母亲(表 2、图 1),其中1例携带突变的父亲表型为FS+(家系21),智力正常。4例携带突变的父母一方表型为FS(家系22、家系23、家系24和家系25),智力均正常。
讨论
Dravet综合征的主要致病基因为SCN1A,目前发现该基因是与癫痫发病相关的最重要的基因之一[
DS患儿多数为散发病例,少数患儿可有热性惊厥或癫痫家族史,家系成员的临床表型轻重不一。文献报道SCN1A阳性的DS患儿中大多数突变为新生突变,少数为遗传性突变,且父母一方可能为SCN1A突变嵌合体[16-18]。Depienne等[16]研究了177例SCN1A基因突变患儿父母的SCN1A基因,发现19例遗传性突变,其中采用定量等位基因特异性PCR方法证实12例患儿的父母一方表现为体细胞突变嵌合体。该文献显示DS家系遗传性突变中,部分可为嵌合突变遗传,即携带SCN1A基因突变的父母一方为突变嵌合体,可以遗传给子代,导致表型严重的DS。本研究中有25例患儿为遗传性突变,其中5例父母一方为该基因突变嵌合体,突变定量需进一步研究。
另外由于Sanger测序存在检测极限,本研究组计划对329例新生突变家系进行实时定量测定,在部分“新生突变”家系可能发现Sanger测序图不易发现的嵌合突变。对父亲为突变嵌合体者,可进一步对其精子突变嵌合体进行定量分析,为遗传咨询及产前诊断提供更准确更可靠的指导。
在DS遗传性突变家系中,携带SCN1A基因突变的家系成员临床表型轻重不一,可表现为DS、FS+或FS,也可完全正常[5, 19]。Depienne等[16]报道的19例遗传性突变导致的DS患儿中,10例携带突变的父母一方表型较轻,为FS、FS+、特发性全面性癫痫等,9例表型正常(其中7例为突变嵌合体遗传)。本研究中,20例携带杂合突变的父母一方中,1例表型为DS,10例表型为FS+,5例表型为FS,4例表型正常。在5例携带嵌合突变的父母一方中,1例表型为FS+,4例表型为FS,与遗传性杂合突变的父母相比,表型较轻,与国际报道一致。
DS是一种难治性癫痫综合征,多数患儿预后不良,有智力损害,且癫痫猝死(Sudden unexpected death of epilepsy, SUDEP)发生率高[20]。对疑似DS的患儿进行SCN1A基因突变检测有利于早期明确诊断和指导选择AEDs。对DS患儿SCN1A突变来源进行分析,可指导遗传咨询和产前诊断。